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Consejo Nacional para el Entendimiento Público de la Ciencia.

estudio de las mutaciones puntuales e invisibles en genes de betalactamasas


Miguel Angel Jiménez-Montaño, Manuel Diaz Avila (*), Miguel Angel Méndez Rojas. Departamento de Fisica y Matemáticas (*), Departamento de Química y Biología. Escuela de Ciencias. Universidad de las Américas-Puebla. Sta. Catarina Martir, A.P. 100, Cholula 72820, Puebla. México. Fax. 91 (22) 29 20 66.

1. Introducción.
2. Métodos y técnicas.
3. Resultados.
4. Variación de propiedades en las posiciones analizadas.
5. Análisis de la estructura tridimensional de PC1 y correlación con las otras betalactamasas.
6. Conclusiones.
7. Bibliografía.

RESUMEN.

Las betalactamas son una familia de antibióticos que incluyen a las penicilinas y a las cefalosporinas, las cuáles actuan destruyendo la pared celular bacteriana. Su mecanismo de acción consiste en la inhibición de la síntesis de un mucopéptido de la pared bacteriana, afectando su unidad estructural. La bacteria muere al reproducirse, porque al exigir un máximo esfuerzo a la pared, ésta estalla. Los microbios se defienden empleando enzimas especiales llamadas betalactamasas, que inhiben a los antibióticos mediante la hidrolización del anillo lactámico. Nos propusimos analizar las posiciones en los sitios de mutación encontrados por Stemmer (1994) en sus mutantes extrapolando estas posiciones en las siguientes betalactamasas: SHV-2, SHV-5, SHV-7, OXA-3, OXA-10, OXA-11 y CARB-2 las cuales no habían sido alineadas en el artículo de Couture (1992) y por tanto, se carecía de tablas que presentaran sus variaciones correspondientes en el árbol filogenético. Además, empleando la estructura tridimensional de la betalactamasas de clase A, PC1, trataremos de inferir algunas consideraciones respecto a la conservación de propiedades en las secuencias.

1. INTRODUCCION.

El desarrollo de antibióticos como la penicilina, proveniente de un hongo, dio muchas esperanzas a la industria farmacéutica en la lucha contra numerosas enfermedades; sin embargo pocos años después de la salida al mercado de la penicilina, se presentaron los primeros casos de resistencia al antibiótico por algunas infecciones. Las compañias farmacéuticas se enfrentaron al problema en un principio mediante la modificación de las estructuras químicas de las b-lactamas, de forma que las enzimas no pudieran reconocerlas y destruirlas. Pronto descubrieron que la solución era temporal ya que las bacterias mutaban sus b-lactamasas para que adquirieran las formas adecuadas para hidrolizar los nuevos antibióticos. Esta lucha costó a la industria farmacéutica francesa 100 millones de dolares.

De esta forma se han desarrollado nuevas generaciones de antibióticos betalactámicos, existiendo para las cefalosporinas hasta tres generaciones. Se ha hablado mucho de una cuarta generación de cefalosporinas, pero es improbable que llegue a producirse, debido a que las compañías farmacéuticas se hallan en los límites en cuanto a su capacidad de manipulación química de los antibióticos. Neu (1992) mostró en su trabajo la "filogenia" de desarrollo de antibióticos en respuesta a la evolución de bacterias resistentes a antibióticos b-lactámicos.

Se propuso como una solución la de acompañar los antibióticos con un inhibidor de la actividad de las b-lactamasas obtenido gracias a la elucidación de la estructura tridimensional de la enzima en 1986 por James Know, de la University of Connecticut, empleando cristalografía de Rayos X. Estos inhibidores son estructural y químicamente similares al antibiótico, pero al sufrir la acción de la enzima, se unen covalentemente a ésta, impidiendo que siga actuando sobre el resto del antibiótico. Sin embargo, la efectividad presentada en un inicio fue rebasada por nuevos casos de resistencia en donde ahora la b-lactamasas se había modificado para hidrolizar tanto al inhibidor como al anillo lactámico.

Las secuencias mutantes se desarrollan por numerosas y desconocidas vías (Couture, 1992). La expansión de la actividad de las b-lactamasas sobre un amplio rango de antibióticos se da por mutaciones puntuales en distintos sitios del gen que modifican las interacciones funcionales entre la enzima y su sustrato. Además las b-lactamasas, a diferencia de otras enzimas, presenta un único sitio activo que no requiere interacción con otro cofactor para llevar a cabo su función. Su capacidad de mutación es tal que permite su estudio en pruebas in vitro, lo cuál no puede realizarse con otros genes que confieren resistencia a antibióticos. Esta posibilidad de estudio ha permitido "fabricar" mutantes de gran resistencia a antibióticos de tercera generación como las cefalosporinas, con los cuáles se han podido observar las mutuaciones puntuales y construir tablas que nos permitan descubrir un orden detrás de ésta capacidad de variación. Se ha demostrado (Jacoby, 1991), que variaciones de una sola base en un gen de betalactamasa, son suficientes para cambiar el sustrato específico de la enzima.

Analizando los trabajos de Stemmer (1994), en los cuáles explica una novedosa técnica de generación de mutantes llamada "Sexual PCR", observamos las variaciones de aminoácidos halladas en los mutantes de TEM-1, que eran más resistentes a cefalosporinas. Anteriormente Jimenez-Montaño et al (1995), habían efectuado un análisis de los patrones de variación de estas mutaciones empleando la estructura del código genético como un hipercubo de seis dimensiones, propuesta por Jimenez-Montaño et al (1992), encontrando que las mismas se explicaban por trayectorias entre los codones vecinos del hipercubo, ya sea en movimientos entre planos o a lo largo de columnas. Este trabajo demostró relaciones entre las mutaciones efectuadas en los mutantes de Stemmer y la mayor resistencias de las b-lactamasas al antibiótico cefalosporina además de descubrir que los cambios no se llevan a cabo al azar, sino que tienen preferencia hacia ciertos sitios.

Couture et al (1992), construyeron un árbol filogenético para explicar la evolución molecular de las betalactamasas de clase A y D. Empleando el alineamiento de 31 betalactamasas presentado en éste trabajo, y de acuerdo a la numeracion de la secuencia (basada en TEM-4) propuesta por Jimenez-Montaño et al (1995), realizaremos un estudio filogenético similar, empleando para el análisis de las variaciones la estructura hipercúbica desarrollada por Jimenez-Montaño et al (1994).

2.METODOS Y TECNICAS

Las secuencias que analizamos las obtuvimos de la base de datos ENTREZ, que se encuentra disponible a través de Internet en la dirección : http://www3.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/ (directa) o a través de http://www.ncbi.nlm.nih.gov y que es mantenida por el National Institute of Health (NIH) de Estados Unidos.
El alineamiento lo obtuvimos de acuerdo al publicado por Couture (1990), para 31 b-lactamasas. Este alineamiento esta determinado por el método progresivo de Feng y Doolittle y la numeración esta dada en base a la secuencia de TEM-4 presentada por Jimenez-Montaño et al (1995).
El análisis de las secuencias de nucléotidos se llevó a cabo empleando el paquete Genesys, el cual permite visualizar en el hipercubo las trayectorias de cambio de bases de los codones entre sus nodos vecinos. Dichos cambios pueden presentarse en planos o columnas, bajo transformaciones de un solo bit o de dos, de acuerdo a las categorizaciones de las transformaciones presentadas por Jimenez-Montaño et al (1995).

Las propiedades empleadas para determinar sitios de conservación en las secuencias y posiciones analizadas, se obtuvieron de un archivo disponible a través de Internet en la dirección: ftp://ftp.genome.ad.jp/pub/db/genomenet/aaindex, de donde seleccionamos aquellas que pudieran darnos más información sobre las características del aminoácido que pudieran ser importantes de conservar en un momento dado como son hidrofobicidad, polaridad, volúmen, tamaño, estabilidad en soluciones acuosas, etc.


3. RESULTADOS.


Analisis de posiciones:

Se muestra en la siguiente tabla, la comparación de variaciones de aminoácidos en las betalactamasas analizadas.

Tipo 18 42 92 104 182 238 241
TEM-1 A A G E M G R
TEM-28 A A G E M G R
SHV-1 T G E D T G R
SHV-2 T G E D T S R
SHV-5 T G E D T S R
SHV-7 T G E D T S R
OXA-2 A A E N A G -
OXA-3 G A E K A G -
OXA-5 F V E P A G V
OXA-10 C V E P A G V
OXA-11 C V E P A G V
CARB-2 S A N T T G F
CARB-3 S A N T T G F
CARB-4 S A K T T T F
PC1 - A N A T A Y
ROB-1 - A N S T G Y
LCR-1 A V E Q A T -
PSE-2 C V E P A G V
PSE-4 S A N T T G F
ST-1 V A G K T S R
ST-2 A G S K T S H
ST-4 A A G K T S R

No frecuent. segun Stemmer
V S K M S H
No frecuent. de acuerdo a Diaz-Mendez
V, C, F S, K E, Q M A, T H

Es de notarse que los mutantes de Stemmer acumulan una gran cantidad de variaciones y presentan aminoácidos no frecuentes en forma más marcada que las otras betalactamasas. Esto ya había sido observado por Jimenez-Montaño et al (1995), pero se muestran 5 variaciones en cuanto a los aminoácidos no frecuentes en las posiciones 18, 92, 104 y 238. Cabe aclarar que deberían esperarse muchas variaciones ya que no todas las betalactamasas analizadas tienen especificidad para el mismo tipo de antibiótico, así que las que se muestran únicamente nos dan información en cuanto al cambio de especificidad de sustrato en las diferentes enzimas y a su evolución molecular.

Comparación de codones para el análisis en hipercubo:

Tipo 18 42 92 104 182 238 241
SHV-1 ACC GGC GAG GAC ACC GGC CGG
SHV-2 ACC GGC GAG GAC ACC AGC CGG
SHV-5 ACC GGC GAG GAC ACC AGC CGG
SHV-7 ACC GGC GAG GAC ACC AGC CGG
OXA-2 GCC GCC GAG ACC GCG GGC -
OXA-3 GGC GCC GAG AAA GCA GGC -
OXA-5 UUU GUA GAA CCC GCA GGU GUU
OXA-10 UGU GUC GAG CCA GCA GGU GUG
OXA-11 UGU GUC GAG CCA GCA GGU GUG
CARB-2 UCC GCU AAU ACC ACU GGC UUU
CARB-3 UCC GCU AAU ACC ACU GGC UUU
CARB-4 UCU GCG AAG ACC ACU GGC UUU
PC1 - GCU AAU GCU ACA GCA UAU
ROB-1 - GCC AAU AGU ACA GGU UAU
LCR-1 GCG GUC GAG CAG GCG ACC -
PSE-2 UGU GUC GAG CCA GCA GGU GUG
PSE-4 UCC GCU AAU ACC ACU GGC UUU

Los datos anteriores sirvieron para alimentar el lector de secuencias del Genesys, y con ello construir las trayectorias de cambio en el hipercubo. En el mismo paquete es posible hacer visualización de las propiedades en cada uno de los nodos marcados por la secuencia leida. Sin embargo, ya que se presentan las gráficas de las trayectorias de variación en el anexo, la siguiente tabla buscará complementar la información presentando siete propiedades fisicoquímicas de los aminoácidos en cada posición y sus respectivas variaciones.

Esta es una de las trayectorias analizadas en su visualización en el hipercubo. Las otras se muestran en un trabajo más extenso que los autores ponen a su disposición previa petición por correo electrónico.


4. Variación de propiedades en las posiciones analizadas.

 
1 2 3 4 5 6 7
Posición 18
ACC (A) 001111 0.61 52.6 -0.368 100 1 8.1 154.33
GCC (A) 011111 0.61 52.6 -0.368 100 1 8.1 154.33
GCG (A) 011101 0.61 52.6 -0.368 100 1 8.1 154.33
UCC (S) 101111 0.05 54.9 -0.524 120 1.6 9.2 174.06
UCU (S) 101110 0.05 54.9 -0.524 120 1.6 9.2 174.06
UGU (C) 100110 1.07 68.3 4.53 20 2.43 5.5 219.79
GGC (G) 010111 0.07 36.3 -0.525 49 0 9 127.90
UUU (F) 101010 2.02 113.9 1.06 41 5.89 5.2 204.74

Posición 42
GGC (G) 010111 0.07 36.3 -0.525 49 0 9 127.90
GCC (A) 011111 0.61 52.6 -0.368 100 1 8.1 154.33
GCU (A) 011110 0.61 52.6 -0.368 100 1 8.1 154.33
GUC (V) 011011 1.32 85.1 0.401 74 3 5.9 207.60
GUA (V) 011000 1.32 85.1 0.401 74 3 5.9 207.60

Posición 92
GAG (E) 010001 0.47 84.7 1.77 102 3.78 12.3 223.16
GAA (E) 010000 0.47 84.7 1.77 102 3.78 12.3 223.16
AAU (N) 000010 0.06 75.7 0 134 2.95 11.6 207.90
AAG (K) 000001 1.15 105.1 0 56 4.77 11.3 300.46

Posición 104
AAA (K) 000000 1.15 105.1 0 56 4.77 11.3 300.46
CAG (Q) 110001 0.0 89.7 0.731 93 3.95 10.5 235.51
ACC (T) 001111 0.05 71.2 0 97 2.6 8.6 205.80
CCC (P) 111111 1.95 73.6 -2.24 56 2.72 8 179.93
CCA (P) 111100 1.95 73.6 -2.24 56 2.72 8 179.93
GCU (A) 011110 0.61 52.6 -0.368 100 1 8.1 154.33
AGU (S) 000110 0.05 54.9 -0.524 120 1.6 9.2 174.06

Posición 182
ACC (T) 001111 0.05 71.2 0 97 2.6 8.6 205.80
ACU (T) 001110 0.05 71.2 0 97 2.6 8.6 205.80
ACA (T) 001100 0.05 71.2 0 97 2.6 8.6 205.80
GCA (A) 011100 0.61 52.6 -0.368 100 1 8.1 154.33
GCG (A) 011101 0.61 52.6 -0.368 100 1 8.1 154.33

Posición 238
GGC (G) 010111 0.07 36.3 -0.525 49 0 9 127.90
GGU (G) 010110 0.07 36.3 -0.525 49 0 9 127.90
AGC (S) 000111 0.05 54.9 -0.524 120 1.6 9.2 174,06
ACC (T) 001111 0.05 71.2 0 97 2.6 8.6 205.80
GCA (A) 011100 0.61 52.6 -0.368 100 1 8.1 154.33

Posición 241
UAU (Y) 100010 1.88 116.2 4.91 41 6.47 6.2 229.15
UUU (F) 101010 2.02 113.9 1.06 41 5.89 5.2 204.74
GUU (V) 011010 1.32 85.1 0.401 74 3 5.9 207.60
GUG (V) 011001 1.32 85.1 0.401 74 3 5.9 207.60
CGG (R) 110101 0.6 109.1 -1.03 65 6.13 10.5 341.01
Clave:
1- Hidrofobicidad (Argos 1982)
2- Volumen del residuo (Bigelow 1967)
3-Energías libres en solución acuosa (Charton-Charton 1982)
4-Mutabilidad relativa (Dayhoff 1978)
5-Volumen de Van der Waals (Fauchere 1988)
6- Polaridad (Grantham 1974)
7- Entropía de formación (Hutchens 1970)
5. Análisis de la estructura tridimensional de PC1 y correlación con las otras betalactamasas.

Según Herzberg (1987), la betalactamasa PC1 presenta una estructura poco común, en la cuál el sitio activo esta formado por los aminoácidos Ser70, Lys73, Glu166 y Lys234. Haciendo la observación en los alineamientos, observamos que el sitio activo se conserva en la mayoría de las b-lactamasas que analizamos, aunque hay ciertas variaciones como se muestra en la siguiente tabla: Aminoácido en pc1:

shv-2   shv-5   shv-7   oxa-3   oxa-10  oxa-11
Ser70   AGC (S) AGC (S) AGC (S) UCG (S) UCA (S) UCA (S)
Lys73   AAA (K) AAA (K) AAA (K) AAG (K) AAG (K) AAG (K)
Glu166  CCG (P) CCG (P) CCG (P) CAA (Q) GUU (V) GUU (V)
Lys234  AAU (N) AAU (N) AAU (N) GUA (V) GUU (V) GUU (V)3

Del análisis de esas posiciones en el alineamiento de secuencias se observa que hay conservación del sitio activo en 70 y 73 relativas a PC1, y en 234 las variaciones son más frecuentes.
6. CONCLUSIONES

El análisis de las variaciones en el hipercubo demostró que existen trayectorias de mutación preferentes que involucran cambios de un bit en el mejor de los casos. Por lo tanto estas mutaciones no son completamente aleatorias ni sus mecanismos son tan oscuros como sugiere Davies (1994).
En las mutaciones se presenta una conservación de ciertas propiedades las cuales tienen que ver con su posición en la estructura tridimensional.
Existe conservación del sitio activo aunque las variaciones que se presentan serán estudiadas posteriormente.
Finalmente, se confirma que las mutaciones puntuales propician cambios en la estructura y por consiguiente en la especificidad de la enzima, sólo aquellas bacterias que desarrollen betalactamasas resistentes a nuevos antibióticos sobrevivirán para transmitir el gen mejorado a sus descendientes.
7. Referencias Bibliográficas.

    COUTURE, F., J. LACHAPEL, R.C. LEVESQUE. 1992. Philogeny of LCR-1 and OXA-5 with class-A and class-D betaLactamases. Mol. Microb. 6: 12, 1693-1705.
    DAVIES, J., 1994. Inactivation of Antibiotics and the Dissemination of Resistance Genes. Science, 264: 375-381, Abril.
    HERZEBERG O. and J. MOULT., 1987. Bacterial Resistance of betalactam Antibiotics: Crystal Structure of betalactamase from Staphylococcus aureus PC1 at 2.5 Å Resolution. Science, 236: 694-701, Mayo.
    JACOBY, G.A. y A.A. MEDEIROS, 1991. More extended-spectrum betalactamases. Antimicrob. Agents. Chemother, 35: 1697-1703.
    JIMÉNEZ-MONTAÑO, M.A.,R. DE LA MORA-BASAÑEZ and PÖSCHEL, T., 1995. The Hypercube Structure of the Genetic Code Explains Conservative and Non-Conservative Aminoacids Substitutions in vivo and in vitro. Byosistems (en prensa).
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    JIMENEZ-MONTAÑO, M.A., R. DE LA MORA-BASAÑEZ, 1992. The genetic code as a six-dimensional boolean hypercube. Abstracts Society for Math. Biol. Annual Meeting. Berkeley, CA, pp. 14.
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    NEU, H.C.,1992. The crisis in Antibiotic Resistance. Science, 257: 1064-9.
    STEMMER, W.P.C., 1994. DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 10747-10751.
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