Introducción.
El tradicional dogma de que los anticuerpos están restringidos al ambiente extracelular ha quedado atrás, y ahora ya es ampliamente aceptado que algunos autoanticuerpos pueden penetrar a la célula. Los mecanismos de penetración aún se desconocen, pero se sabe que los anticuerpos atraviesan la membrana plasmática hasta el citoplasma y posteriormente pueden ser transportados hasta el núcleo donde se acumulan. Entre los anticuerpos que pueden penetrar a la célula están los anticuerpos anti-DNA. Estos anticuerpos reconocen y se unen a DNA de doble cadena o de cadena simple. Se ha observado además que la penetración de estos anticuerpos puede alterar las funciones celulares e incluso inducir la muerte apoptótica de la célula. Sin embargo, no todos los anticuerpos anti-DNA pueden penetrar a la célula y de los anticuerpos que penetran sólo algunos causan alteraciones celulares.
Una posible explicación de la diferente acción de los anticuerpos anti-DNA sería que estos anticuerpos interactúan selectivamente con regiones de regulación genética, provocando una alteración en la expresión de los genes. Esta selectividad podría estar determinada por la capacidad del anticuerpo de reconocer y unirse a una secuencia específica de DNA.
Objetivo.
En este trabajo se analizará la capacidad de 4 anticuerpos monoclonales anti-DNA para unirse de esta manera selectiva a secuencias específicas de DNA.
Metodología.
Se desea determinar la selectividad por secuencias de 4 anticuerpos monoclonales anti-DNA ofreciendole a los anticuerpos una población de oligonucléotidos de secuencia aleatoria. Las secuencias “preferidas” se preparan por electroforesis de las “rechazadas”. Las primeras se extraen del gel y se amplifican por PCR para volverlas a incubar con los anticuerpos. Este proceso se repite varias veces. Finalmente se determinan las secuencias seleccionadas por secuenciación, y posteriormente, en ensayos de competición se tendrá que determinar la afinidad del anticuerpo por estas secuencias específicas. Resultados.
Se ha diseñado un oligonucléotido sintético de 53nt que tiene todos los elementos necesarios para los experimentos planteados: 6nt aleatorios en el centro de la selección, más secuencias constantes en las extremidades para la amplificación y secuenciación. Se han encontrado condiciones óptimas para la selección de secuencias específicas por los anticuerpos monoclonales. Actualmente se han realizado ya 4 ciclos de selección y amplificación. Después del quinto ciclo se procederá con la secuenciación y con los ensayos de competición.
ConclusionesCon los experimentos propuestos se determinará si los anticuerpos monoclonales anti-DNA reconocen secuencias específicas o si sólo reconocen al DNA por su esqueleto deoxirribofosfórico. La descripción del epítope de DNA reconocido ampliará la comprensión del posible efecto de anticuerpos anti-DNA en la penetración. Esto a su vez aumentará el entendimiento del papel de los anticuerpos como reguladores del sistema inmune. Además, la descripición de anticuerpos específicos para secuencias abrirá el campo de la investigación, ya que se podrá especular en el diseño de anticuerpos monoclonales que intervengan en la expresión genética con fines científicos, o eventualmente hasta terapéuticos.